Beschreibung

Technische Parameter

Produkteinführung

Produktname	Katze. NEIN.	Spez.
2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix	G3326-00	200 μL
	G3326-01	1 ml
	G3326-05	5×1 ml
	G3326-15	15×1 ml

Produktbeschreibung/Einführung

2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix ist ein spezieller 2×-Vormix für qPCR-Reaktionen unter Verwendung der chimären Fluoreszenzmethode SYBR Green I. Die Kernkomponente der Taq-DNA-Polymerase ist eine Hot-Start-DNA-Polymerase, die auf der Antikörper-Einschlussmethode basiert und unspezifische Amplifikation unter Niedrigtemperaturbedingungen wirksam hemmen kann. Gleichzeitig ist sie mit dem für qPCR optimierten Reaktionspuffer ausgestattet Sehr gut geeignet für die qPCR-Reaktion mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit. Es kann eine gute Standardkurve innerhalb eines breiten quantitativen Bereichs erhalten und das Zielgen genau, reproduzierbar und äußerst zuverlässig quantifizieren. Gleichzeitig enthält das Produkt einen speziellen passiven ROX-Referenzfarbstoff, der für die Verwendung in allen qPCR-Geräten geeignet ist und eine Anpassung der ROX-Konzentration auf verschiedenen Geräten nicht erforderlich ist. Der vorgemischten Lösung wird unter Zugabe von Tracer ein blauer Farbstoff zugesetzt, während gleichzeitig die Bereitstellung von gelbem Templat-Verdünnungsmittel unterstützt wird. Wenn das Templat mit gelbem Templat-Verdünnungsmittel verdünnt und der vorgemischten blauen Reaktionslösung hinzugefügt wird, ändert sich die Farbe von Blau Zu Grün kann das Reaktionssystem so formuliert werden, dass es eine Rolle bei der Verfolgung des Reaktionssystemprozesses spielt, um das Auslaufen der Zugabe oder eine falsche Zugabe zu verhindern. Die Spektren dieses blauen und gelben Farbstoffs überlappen nicht mit denen des qPCR-Farbstoffs und haben keinen Einfluss auf die Ergebnisse der Reaktion.

Lager- und Versandbedingungen

Schiff mit nassem Eis; Bei -20 Grad lagern, 12 Monate gültig.

Produktinhalte

Komponentennummer	Komponente	G3326-00	G3326-01	G3326-05	G3326-15
G3326-1	2x Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix	200 μL	1 ml	5 x 1 ml	15 x 1 ml
G3326-2	40x gelber Template-Verdünnungspuffer	200 μL	1 ml	1 ml	1 ml
Handbuch		Ein Exemplar

Testprotokoll/-verfahren

1. (Optionale) Vorlagenverdünnung

Der gelbe Probenpuffer wird in einer 40-fachen Konzentration für die DNA-Template-Verdünnung geliefert, wodurch durch die Änderung der Flüssigkeitsfarbe genau bestimmt werden kann, ob das Template zur qPCR-Reaktionslösung hinzugefügt wurde. Am Beispiel des 20-μL qPCR-Reaktionssystems kann entsprechend der Menge der Verdünnungsvorlage, die der 20 μL qPCR-Reaktionslösung hinzugefügt wurde, die entsprechende Verdünnungsmethode der Originalvorlage der folgenden Tabelle entnommen werden (wobei die Originalvorlage verdünnt wird). auf 100μL als Beispiel):

Fügen Sie die verdünnte Vorlage zur 20 μl qPCR-Reaktionslösung (μl) hinzu.	1	2	3	4	5	6	7	8
Fügen Sie den 40x GELBEN Template-Verdünnungspuffer zum 100-μL-Template-Verdünnungssystem (μL) hinzu.	50	25	16.7	12.5	10	8.4	7.2	6.3
Fügen Sie das 100-μL-Vorlagenverdünnungssystem zur Primärvorlage (μL) hinzu.	x	x	x	x	x	x	x	x
Volumen der Zugabe von Nuklease – freies Wasser (μL)	50-x	75-x	83.3-x	87.5-x	90-x	91.6-x	92.8-x	93.7-x

Beispiel: 2 μL verdünnte Vorlage sollten zu 20-μL qPCR-Reaktionssystem hinzugefügt werden. Nehmen wir als Beispiel das 100μL-Template-Verdünnungssystem. Wenn das ursprüngliche Template-Volumen 20 μl beträgt, werden 25 μl 40x gelber Template-Verdünnungspuffer hinzugefügt, und dann werden 55 μl nukleasefreies Wasser zum Gesamtvolumen von 100 μl hinzugefügt. Der 40-fache GELBE Template-Verdünnungspuffer ist jetzt 10-fach. Geben Sie 2 μl des verdünnten Templates in ein 20-μl qPCR-Reaktionssystem und die Endkonzentration des 40× GELBEN Template-Verdünnungspuffers beträgt 1x. Wenn Sie die Template-Verdünnung für G3326-2 nicht verwenden möchten, können Sie diesen Schritt ignorieren.

1. 2. Empfohlenes qPCR-Reaktionssystem:

Komponente	20 μL rxn	50 μL rxn	Endgültige Konzentration
2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix	10 μL	25 μL	1×
Vorwärtsprimer (10 μM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Vorlageb	Variable	Variable	nach Bedarf
Nukleasefreies Wasser	Auf 20 μL hinzufügen	Auf 50 μL hinzufügen

a: Normalerweise kann ein guter Verstärkungseffekt mit der Endkonzentration von {{0}}.2 μM erzielt werden. Wenn die Reaktionsleistung schlecht ist, kann die Primerkonzentration im Bereich von 0.2-1.0 μM angepasst werden.

b: Die Menge der hinzugefügten Matrize variiert je nach Anzahl der Kopien des Zielgens, und die geeignete Menge der hinzugefügten Matrize wird durch Gradientenverdünnung untersucht. Die beste Zugabemenge an Template-DNA im 20-μL-Reaktionssystem betrug weniger als 100 ng. Wenn die cDNA (RT-Reaktionslösung) der RT-PCR-Reaktion als Vorlage verwendet wurde, sollte die Zugabemenge 10 % des endgültigen qPCR-Volumens nicht überschreiten.

2. 3. PCR-Reaktionsprogramm (kann entsprechend den Geräten angepasst werden):

A. Zwei-Schritte-Methode					B. Drei-Schritte-Methode
Bühne	Schritt	Zyklusnummer	Temperatur	Zeit	Bühne	Schritt	Zyklusnummer	Temperatur	Zeit
Stufe 1	Vordegeneration	1	95 Grad	30 Sek	Stufe 1	Vordegeneration	1	95 Grad	30 Sek
Stufe 2	Degeneration	40	95 Grad	15 Sek	Stufe 2	Degeneration	40	95 Grad	15 Sek
	Glühverlängerung		60 Grad	30 Sek		Glühen		55-65 Grad	10 Sek
						Verlängerung		72 Grad	30 Sek
Stufe 3	Schmelzkurve	1	Standardeinstellungen des Instruments		Stufe 3	Schmelzkurve	1	Standardeinstellungen des Instruments

a: Wenn die Amplifikationsspezifität verbessert werden muss, kann ein zweistufiges Verfahren oder eine Annealing-Temperatur verwendet werden; Um die Verstärkungseffizienz zu verbessern, kann ein dreistufiges Verfahren oder eine Verlängerungszeit verwendet werden.

Notiz

1. Wenn keine Pipettenverfolgung erforderlich ist, wird die Vorlagenverdünnung nicht mit dem 40×gelben Vorlagenverdünnungspuffer durchgeführt.

2. Bevor Sie die Reagenzien verwenden, schwenken Sie sie bitte vorsichtig auf und ab, um sie zu vermischen. Vermeiden Sie Vortexen und Hin- und Herbewegungen, um Blasen zu vermeiden.

3. Bewahren Sie die Reagenzien bei der Zubereitung der Reaktionslösung auf Eis auf.

4. Dieses Produkt enthält den Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green. Bei der Vorbereitung der PCR-Reaktionslösung sollte starkes Licht vermieden werden.

5. Bitte verwenden Sie für die Vorbereitung und Abgabe der Reaktionslösung neue Einwegspitzen, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben so weit wie möglich zu vermeiden.

6. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen des Master Mix und versuchen Sie, ihn innerhalb eines Monats nach dem Auftauen zu verwenden.

Kompatible Instrumente

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™-Serie, PikoRealTM Cycler;

Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™;

Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;

Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;

IIIumina: Eco QPCR;

Cepheid: SmartCycler®;

Qiagen Corbett: Rotor-Gene®-Serie;

Roche: LightCycler™-Serie;

Takara: Thermal Cycler Dice-Serie;

Analytik: qTOWER-Serie;

qTOWER: LineGene-Serie.

Prinzipien des Primer-Designs

1. Es wird empfohlen, dass die Länge des Amplifikationsprodukts zwischen 80-300 bp liegt;

2. Primerlänge: 18-25 bp;

3. Der Gehalt an Base G+C in Primern sollte zwischen 40 %-60 %;

4. Der Tm-Wertunterschied zwischen Vorwärtsprimern und Rückwärtsprimern beträgt weniger als 2 Grad, und der Tm-Wert zwischen 58-62 Grad ist der beste;

5. Zufälligkeit der Basisverteilung;

6. Primer sollten besser keine selbstkomplementären Sequenzen enthalten, da sie sonst eine sekundäre Haarnadelstruktur bilden;

7. Es sollten nicht mehr als 4 komplementäre oder homologe Basen zwischen zwei Primern vorhanden sein, da sonst ein Primer-Dimer gebildet wird, insbesondere eine komplementäre Überlappung am 3'-Ende;

8. Es wird angenommen, dass die 3'-terminale Base des Primers G oder C ist;

9. In den NCBI-Vergleichsergebnissen wurden keine anderen unspezifischen Produkte gefunden.

Fehlerbehebung

Problembeschreibung	Mögliche Gründe	Lösungen
Am Ende der Reaktion erschien keine Amplifikationskurve oder der CT-Wert erschien zu spät	Die Templatkonzentration ist zu niedrig	Wiederholen Sie das Experiment, um die Template-Verdünnung um ein Vielfaches zu reduzieren, und beginnen Sie mit der höchsten Konzentration, wenn die Probenkonzentration unbekannt ist
	Verschlechterung der Vorlage	Die Vorlage wurde erneut vorbereitet und das Experiment wiederholt
	Es gibt PCR-Inhibitoren im System	Im Allgemeinen wird das Templat eingebracht, das Verdünnungsverhältnis des Templats erhöht oder das Templat mit hoher Reinheit erneut hergestellt und wiederholt
	Primer können sich verschlechtern	Primer, die längere Zeit nicht verwendet wurden, sollten zunächst mittels PAGE-Elektrophorese auf ihre Integrität getestet werden, um die Möglichkeit einer Degradation auszuschließen
	Geringe Verstärkungseffizienz	Erhöhen Sie die Primerkonzentration, versuchen Sie ein dreistufiges Amplifikationsverfahren oder entwerfen Sie den Primer neu
	Das Verstärkungsprodukt ist zu lang	Die Länge des Amplifikationsprodukts wurde im Bereich von 80-300 bp kontrolliert
Das leere Steuerelement zeigt das Signal an	Verschmutzung des Reaktionssystems	Zunächst sollte das Blindkontrollwasser ersetzt werden. Sollte die gleiche Situation immer noch auftreten, sollten die Primer, Aspiratoren und PCR-Röhrchen ausgetauscht oder ein neuer Master Mix gestartet werden. Das Reaktionssystem wird in einem superreinen Tisch vorbereitet, um die Aerosolverschmutzung zu reduzieren
Das leere Steuerelement zeigt das Signal an	Es kommt zu unspezifischer Amplifikation wie Primer-Dimeren	Im Allgemeinen ist es normal, dass die Amplifikationsprodukte nach 35 Zyklen in der Blindkontrolle auftauchen, was anhand der Schmelzkurve analysiert werden sollte. Entwerfen Sie den Primer neu, passen Sie die Primerkonzentration an oder optimieren Sie den PCR-Reaktionsablauf
Die Schmelzkurve weist mehrere Spitzen auf	Das Primerdesign ist schlecht	Die neue Zündhütchen wurden nach den Grundprinzipien des Zündhütchendesigns neu gestaltet
	Die Primerkonzentration ist zu hoch	Reduzieren Sie die Primerkonzentration entsprechend
	Es liegt eine genomische Kontamination in der cDNA-Matrize vor	Die extrahierte RNA-Lösung wird mit DNA-Enzymen wie dsDNase verdaut, um genomische Kontaminationen zu entfernen oder Transintron-Primer zu entwerfen
Schlechte Reproduzierbarkeit der Experimente	Der Fehler beim Hinzufügen einer Probe ist groß	Die Verwendung einer präzisen Pipette mit hochwertigem Saugkopf und präziser Pipette; Vorlage mit hoher Verdünnung, Hinzufügen einer Vorlage mit großem Volumen, um Probenahmefehler zu reduzieren; Das Reaktionsvolumen der qPCR wurde vergrößert
	Die Templatkonzentration ist zu niedrig	Wiederholen Sie das Experiment, um die Verdünnungszeiten der Vorlage zu verkürzen
	Temperaturabweichung an verschiedenen Standorten des qPCR-Geräts	Kalibrieren Sie das qPCR-Gerät regelmäßig
Die Verstärkungskurve ist nicht glatt	Das Fluoreszenzsignal ist nach einer Systemkorrektur zu schwach	Stellen Sie sicher, dass die im Master Mix vorgemischten Farbstoffe nicht zersetzt werden; Ersetzen Sie das Fluoreszenzsignal, um bessere qPCR-Verbrauchsmaterialien zu sammeln
Die Verstärkungskurve bricht oder rutscht ab	Die Template-Konzentration war höher und der Ausgangsendpunktwert war größer als der CT-Wert	Der Basisendpunkt (Ct-Wert -3) wurde reduziert und die Daten wurden erneut analysiert
Die Verstärkungskurven einzelner Wells fielen plötzlich stark ab	Im Reaktionsgefäß befinden sich Blasen	Stellen Sie sicher, dass die Mischung vollständig aufgelöst ist und nicht gleichmäßig wirbelt und oszilliert. Nach Zugabe der Probe werden die Blasen durch Zentrifugation mit leichtem Elastik entfernt. Die Vordenaturierungszeit wurde auf 10 Minuten verlängert, um die Blasen zu entfernen

Nur für Forschungszwecke!

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2×Universal Blue SYBR Green QPCR Master Mix mit 40×Yellow Template Dilution Buffer