2×In-Fusion Klonen Mix Plus

 

Produktname	Katze. NEIN.	Spez.
2×In-Fusion Klonen Mix Plus	G3351-20T	20 T
	G3351-100T	100 T

 

Der 2×In-Fusion Cloning Mix Plus bietet eine höhere Klonierungseffizienz im Vergleich zu früheren Generationen von In-Fusion-Kits (G3350,2×In-Fusion Cloning Mix), insbesondere für mehrere Fragmente. Es ist für die schnelle, gerichtete Klonierung von einem oder zwei bis fünf DNA-Mehrfachfragmenten in einen beliebigen Vektor konzipiert. Es fusioniert DNA-Fragmente (z. B. PCR-generierte Inserts und linearisierte Vektoren) effizient und präzise, ​​indem es 15-25 bp-Überlappungen an ihren Enden erkennt. Diese 15-25 bp-Überlappungen können durch die Entwicklung von Primern für die Amplifikation der gewünschten Sequenzen konstruiert werden. Die gleichzeitige Einfügung mehrerer Fragmente vereinfacht die experimentellen Schritte erheblich, verbessert die Klonierungseffizienz und spart Zeit.

 

1.Einzelfragment-Primerdesign: 15-25 bp-Sequenzen, die mit beiden Enden des linearisierten Vektors übereinstimmen, wurden in das 5'-Ende des Amplifikationsprimers des Inserts eingeführt. Entwerfen Sie das folgende Diagramm:

2.Multifragment-Primer-Design: Die Prinzipien des Primer-Designs an beiden Enden des Vektors sind die gleichen wie bei Einzelfragment-Primern. Das Designprinzip der Reset-Zone zwischen Fragment-Primern lautet wie folgt: Es gibt eine Überlappung von 15-25 bp zwischen dem Reverse-Primer von Fragment 1 und dem Forward-Primer von Fragment 2. Der Reverse-Primer für Fragment 1 umfasst den überlappenden Bereich und den Reverse-Spezifikum In der Primerregion umfasst der Vorwärtsprimer für Fragment 2 die überlappende Region und die vorwärtsspezifische Primerregion usw. (überlappende Regionen werden rot angezeigt). Um die Effizienz zu verbessern, können die überlappenden Bereiche zwischen Fragmenten vergrößert werden und ihre Tm-Werte sind garantiert konsistent. Der Entwurf ist wie folgt:

 

 

Schiff mit nassem Eis; gespeichert bei -20 Grad, gültig für 12 Monate.

 

 

Komponente	G3351-20T	G3351-100T
2×In-Fusion Klonen Mix Plus	100 μL	5 x 100 μL
pUC19 (linearisiert, Kontrollvektor, 5 ng/μL)	10 μL	10 μL
Kontrolleinsatz (10 ng/μL)	10 μL	10 μL
Handbuch	Ein Exemplar

 

 

Führen Sie eine Ligationsreaktion durch

1. Geben Sie Folgendes in ein autoklaviertes 1,{2}}ml-Mikrozentrifugenröhrchen (empfohlenes 10-uL-Reaktionssystem):

Komponente	Volumen
2×In-Fusion Klonen Mix Plus	5 μL
Vektor-DNA	X μL
DNA einfügen	Y μL
Nukleasefreies Wasser	Auf 10 μL hinzufügen

 

2. Vorsichtig mischen und kurz zentrifugieren, um den Inhalt auf den Boden des Röhrchens zu bringen.

3. Für Einzelfragment-Rekombinationsreaktionen 15 Minuten bei 50 Grad inkubieren; Für die Rekombination mehrerer Fragmente 30 Minuten bei 50 Grad inkubieren.

 

NOTIZ:Für die 3-5-Rekombination mehrerer Fragmente führt eine Erhöhung der Reaktionszeit zu mehr Kolonien, sollte jedoch 1 Stunde nicht überschreiten.

4. Stellen Sie das Röhrchen auf Eis und fahren Sie sofort mit „Transformationsreaktion durchführen“ fort.

 

 

5. Geben Sie die entsprechende Ligationsreaktion in chemisch kompetente E. coli (z. B. DH5, Top10 usw.) und mischen Sie vorsichtig. Mischen Sie nicht durch Auf- und Abpipettieren.

6. 30 Minuten auf Eis inkubieren.

7. Setzen Sie die Zellen 30 Sekunden lang einem Hitzeschock in einem 42-Grad-Wasserbad aus.

8. Stellen Sie die Röhrchen sofort auf Eis und inkubieren Sie sie 2 Minuten lang.

9. Fügen Sie 900 µL SOC- oder LB-Medium bei Raumtemperatur hinzu. Verschließen Sie das Röhrchen fest und schütteln Sie das Röhrchen 1 Stunde lang bei 37 Grad horizontal bei 225 U/min.

10. Verteilen Sie das erforderliche Volumen der Transformationsreaktion auf einer vorgewärmten LB-Platte, die entsprechende Antibiotika enthält.

11. Platten über Nacht bei 37 Grad inkubieren.

 

 

Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der Transformationsplatte aus und analysieren Sie die Transformanten durch Kolonie-PCR oder Restriktionsenzymverdau.

 

 

1. Die Vektor-DNA und die Insert-DNA sollten gelgereinigt werden und ihre Qualität und Konzentration durch Elektrophorese analysiert werden. Wenn die Konzentration niedrig ist, kann bei der Ligationsreaktion auf Wasser verzichtet werden.

2. The Tm value between the overlapping regions of multiple fragments should be consistent and >60 Grad.

3. Es wird empfohlen, dass das Molverhältnis von Vektor und Insert 1:1 bis 1:3 beträgt; Wenn 2-3-Fragmente verbunden sind, beträgt das Molverhältnis zwischen den einzelnen Fragmenten 1:1 und das Ligationsreaktionssystem kann in gleichen Anteilen vergrößert werden.

4. Wenn das Gesamtvolumen von Vektor und Insert mehr als 5 μL beträgt, können Sie das Ligationssystem auf 20 μL skalieren.

5. Das Volumen des Ligationsprodukts sollte 1/10 des Volumens der kompetenten Zellen nicht überschreiten, da sonst die Transformationseffizienz erheblich verringert wird. Das Volumen des Ligationsprodukts und der kompetenten Zellen kann in gleichen Anteilen erhöht werden (z. B. wandeln 20 μL des Ligationssystems 200 μL kompetente Zellen um).

6. Der 2×Universal Ligation Mix sollte bis zu 5-10 Minuten nach der Verwendung bei einem Grad von -20 aufbewahrt werden und nach dem Gebrauch sofort wieder auf einen Grad von -20 gebracht werden. Es wird empfohlen, Aliquots einzufrieren, um die Gefrier-Tau-Zyklen zu verkürzen.

7. Wenn zur Transformation Elektroporation verwendet wird, sollten Vektor-DNA und Insert-DNA durch die Säulenmethode oder die Ethanol-Fällungsmethode gereinigt werden.

 

 

1. Das experimentelle Prozessdiagramm des rekombinanten Plasmidkonstrukts

 

A. Insert-DNA-Fragmente wurden durch PCR-Amplifikation erhalten: Die 15-25 bp homologe Sequenz (grün und hellblau) vom linearisierten Vektorende wurde in das 'Ende der Vorwärts-/Rückwärtsprimer des Zielfragments eingeführt und die Die 5'- und 3'-Endsequenzen des amplifizierten Produkts stimmten jeweils vollständig mit den beiden Endsequenzen des linearisierten Vektors überein.

B. Plasmidvektorlinearisierung: Restriktionsendonuklease oder Reverse-PCR wurden verwendet, um linearisierte Vektoren zu erhalten.

C. In-Fusion Cloning Plus: Der linearisierte Träger und das gereinigte und gewonnene Insert-Fragment wurden im Verhältnis gemischt und die Reaktion wurde 15 Minuten lang bei 50 Grad abgeschlossen.

D. Transformierte Zellen: Reaktionsprodukte direkt in kompetente Escherichia coli-Zellen, monoklonales Koloniewachstum, Auswahl aus der Tablette für PCR, Enzymverdauung und Sequenzierung, experimentelles Screening positiver Klone.

 

2. Einzelpunktmutationen rekombinantes Plasmidkonstrukt experimentelles Prozessdiagramm

A. Zwei-Fragment-PCR (PCR amplifiziert DNA-Fragmente an beiden Enden der Mutationsstelle): An der Mutationsstelle (orange) wurden komplementäre Primer entworfen, und an beiden Enden des mutierten Gens wurden Primer entworfen, um am Ende homologe Sequenzen einzuführen des 15-25 bp linearisierten Vektors (grün und hellblau). Unter Verwendung unterschiedlicher Primer für die PCR-Amplifikation werden jeweils Mutationen in zwei Stücke mit den homologen Sequenzen von zwei Insert-Fragmenten (einschließlich) Genmutationen eingefügt.

B. Plasmidvektorlinearisierung: Restriktionsendonuklease oder Reverse-PCR wurden verwendet, um linearisierte Vektoren zu erhalten.

C. In-Fusion Cloning Plus: Der linearisierte Träger und das gereinigte und gewonnene Insert-Fragment wurden im Verhältnis gemischt und die Reaktion wurde 15 Minuten lang bei 50 Grad abgeschlossen.

D. Transformierte Zellen: Reaktionsprodukte direkt in kompetente Escherichia coli-Zellen, monoklonales Koloniewachstum, Auswahl aus der Tablette für PCR, Enzymverdauung und Sequenzierung, experimentelles Screening positiver Klone.

 

3. Schematische Darstellung des experimentellen Prozesses der rekombinanten Plasmidkonstruktion mit Multifragment-Insertion

A. PCR-Amplifikation zusätzlicher Fragmente: Die homologen Sequenzen (markiert grün, dunkelblau, gelb und hellblau) wurden an das 5'-Ende der Amplifikationsprimer angefügt, sodass zwischen ihnen eine 15-25 bp homologe Sequenz vorhanden war Amplifikationsprodukten und zwischen den Amplifikationsprodukten und dem linearisierten Vektor. Zur Amplifikation der DNA-Fragmente wurden verschiedene Primerpaare verwendet (orange, rot und violett markiert).

B. Plasmidvektorlinearisierung: Restriktionsendonuklease oder Reverse-PCR wurden verwendet, um linearisierte Vektoren zu erhalten.

C. In-Fusion Cloning Plus: Der linearisierte Träger und das gereinigte und gewonnene Insert-Fragment wurden im Verhältnis gemischt und die Reaktion wurde 15 Minuten lang bei 50 Grad abgeschlossen.

D. Transformierte Zellen: Reaktionsprodukte direkt in kompetente Escherichia coli-Zellen, monoklonales Koloniewachstum, Auswahl aus der Tablette für PCR, Enzymverdauung und Sequenzierung, experimentelles Screening positiver Klone.

 

Nur für Forschungszwecke!

 

 

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